Bruk og forholdsregler for ultrafiltreringssentrifugerør
1) Velg et passende ultrafiltreringsrør.Merk at UF-membraner varierer i toleransenivå for ulike kjemikalier.Typisk kan ultrafiltreringsrør med en molekylvektsgrense på 10 kDa velges med en molekylvektgrense som ikke bør være større enn 1/3 av molekylvekten til proteinet av interesse, slik som 35 kDa.Hvis molekylvekten til proteinet av interesse er rundt 10 kd, kan et ultrafiltreringsrør med en molekylvektsgrense på 3 KD brukes.
(2) Ultrafiltreringen, nyinnkjøpt, er tørr, med ultrarent vann tilsatt før bruk og vann passert fullstendig gjennom membranen, isbadet eller kjøleskapet forhåndskjølt i noen minutter.Deretter helles vannet av, dvs. proteinvæsken, og hvor mye som tilsettes, avhengig av hva som ikke er mer enn den hvite streken på toppen av røret.Operasjonen er lett, og ultrafiltreringsrøret må forhåndskjøles på is før proteinløsningen tilsettes.
3) Både massen og tyngdepunktet skulle nå balansen.Merk at rotasjonshastigheten og akselerasjonen ikke er veldig rask, ellers skader ultrafiltreringsmembranen direkte.Sentrifugal ultrafiltrering ble startet (sentrifuge forhåndskjølt til 4 grader).Etter at RPM for forskjellige sentrifuger ble konvertert til g, var det annerledes.Akselerasjonen til sentrifugen ble justert til et minimum, noe som reduserte trykket på membranen.Merk, sørg for å forlate sentrifugen etter at sentrifugen har nådd sin destinasjonshastighet, eller hvis du har et problem, kan du ikke håndtere det for første gang.Orienteringen av membranen til spindelen ble justert i henhold til instruksjonene (vinkelsentrifugehuset er membran til akse vinkelrett).Ved praktisk bruk er den generelle rotasjonshastigheten lavere enn i instruksjonene, slik at sentrifugerørets levetid kan forlenges.
3) Både massen og tyngdepunktet skulle nå balansen.Merk at rotasjonshastigheten og akselerasjonen ikke er veldig rask, ellers skader ultrafiltreringsmembranen direkte.Sentrifugal ultrafiltrering ble startet (sentrifuge forhåndskjølt til 4 grader).Etter at RPM for forskjellige sentrifuger ble konvertert til g, var det annerledes.Akselerasjonen til sentrifugen ble justert til et minimum, noe som reduserte trykket på membranen.Merk, sørg for å forlate sentrifugen etter at sentrifugen har nådd sin destinasjonshastighet, eller hvis du har et problem, kan du ikke håndtere det for første gang.Orienteringen av membranen til spindelen ble justert i henhold til instruksjonene (vinkelsentrifugehuset er membran til akse vinkelrett).Ved praktisk bruk er den generelle rotasjonshastigheten lavere enn i instruksjonene, slik at sentrifugerørets levetid kan forlenges.
(4) Når den er konsentrert til de resterende 1 ml, ta 50 ul bufferløsning, tilsett 10 ul av gjennomstrømning og se om det er noen blå farge, som en vurdering om ultrafiltreringsrøret mangler protein.Hvis røret er lekk, hell det øvre laget på nytt og flyt det gjennom inn i et nytt rør for å starte ultrafiltrering.For å fastslå nøyaktig om rørene ble savnet, sentrifuger i 10 minutter med 5mgml BSA før gjennomstrømning, kjør på proteinlim eller Bradford råoljeanalyse, og fortsett med å tilsette den gjenværende konsentrerte proteinløsningen (som fungerer på is og hindrer proteiner i å varmes opp) til alt av konsentratet er tilsatt.Vær forsiktig under sentrifugering hvis utfelling av proteiner forekommer, noe som fører til lukking av røret.Hvis nedbør oppstår, avgjør om den spesifikke årsaken til nedbør er en for høy proteinkonsentrasjon eller en upassende buffer;Førstnevnte kan løses ved ultrafiltrering av flere ultrafiltreringsrør samtidig, redusere konsentrasjonen, og sistnevnte ved å bytte ut forskjellige bufferløsninger inntil det ikke forekommer utfelling av proteinet.
(4) Når den er konsentrert til de resterende 1 ml, ta 50 ul bufferløsning, tilsett 10 ul av gjennomstrømning og se om det er noen blå farge, som en vurdering om ultrafiltreringsrøret mangler protein.Hvis røret er lekk, hell det øvre laget på nytt og flyt det gjennom inn i et nytt rør for å starte ultrafiltrering.For å fastslå nøyaktig om rørene ble savnet, sentrifuger i 10 minutter med 5mgml BSA før gjennomstrømning, kjør på proteinlim eller Bradford råoljeanalyse, og fortsett med å tilsette den gjenværende konsentrerte proteinløsningen (som fungerer på is og hindrer proteiner i å varmes opp) til alt av konsentratet er tilsatt.Vær forsiktig under sentrifugering hvis utfelling av proteiner forekommer, noe som fører til lukking av røret.Hvis nedbør oppstår, avgjør om den spesifikke årsaken til nedbør er en for høy proteinkonsentrasjon eller en upassende buffer;Førstnevnte kan løses ved ultrafiltrering av flere ultrafiltreringsrør samtidig, redusere konsentrasjonen, og sistnevnte ved å bytte ut forskjellige bufferløsninger inntil det ikke forekommer utfelling av proteinet.
(5) De første trinnene brukes til å konsentrere proteinet, og hvis bufferen skal endres, tilsett forsiktig ny buffer (ultrafiltrering gjennom en 0,22um ultrafiltreringsmembran) til ca. 1 ml totalt protein, og rekonsentrer til ca. 1 ml i tre påfølgende ganger, med det endelige konsentrerte sluttvolumet avhengig av ønsket proteinkonsentrasjon, vanligvis ikke mer enn 500 ul, men også innenfor 200 ul.Oppnå 1000 × eller mer ved tre anledninger, i hovedsak like mye bufferendring, som beregnet ved minst 10 × eller så volumanrikning hver gang.
(5) De første trinnene brukes til å konsentrere proteinet, og hvis bufferen skal endres, tilsett forsiktig ny buffer (ultrafiltrering gjennom en 0,22um ultrafiltreringsmembran) til ca. 1 ml totalt protein, og rekonsentrer til ca. 1 ml i tre påfølgende ganger, med det endelige konsentrerte sluttvolumet avhengig av ønsket proteinkonsentrasjon, vanligvis ikke mer enn 500 ul, men også innenfor 200 ul.Oppnå 1000 × eller mer ved tre anledninger, i hovedsak like mye bufferendring, som beregnet ved minst 10 × eller så volumanrikning hver gang.
Innleggstid: Nov-09-2022