PCR, er polymerasekjedereaksjonen, som refererer til tilsetningen av dNTP, Mg2+, forlengelsesfaktorer og amplifikasjonsforsterkende faktorer til systemet under katalyse av DNA-polymerase, ved å bruke det overordnede DNAet som en mal og spesifikke primere som utgangspunkt for forlengelsen, Gjennom trinnene med denaturering, annealing, forlengelse, etc., kan prosessen med in vitro replikering av dattertråd-DNA som er komplementær til stamtråd-DNA-et raskt og spesifikt amplifisere ethvert mål-DNA in vitro.
1. Hot Start PCR
Starttidspunktet for amplifikasjon i konvensjonell PCR er ikke å sette PCR-maskinen inn i PCR-maskinen, og deretter begynner programmet å forsterke.Når systemkonfigurasjonen er fullført, begynner forsterkningen, noe som kan forårsake uspesifikk forsterkning, og varmstart-PCR kan løse dette problemet.
Hva er varmstart PCR?Etter at reaksjonssystemet er klargjort, frigjøres enzymmodifikatoren ved høy temperatur (vanligvis høyere enn 90 °C) under det innledende oppvarmingstrinnet av reaksjonen eller "varmstart"-stadiet, slik at DNA-polymerasen aktiveres.Den nøyaktige aktiveringstiden og temperaturen avhenger av arten av DNA-polymerasen og varmstartmodifikatoren.Denne metoden bruker hovedsakelig modifikatorer som antistoffer, affinitetsligander eller kjemiske modifikatorer for å hemme aktiviteten til DNA-polymerase.Siden aktiviteten til DNA-polymerase hemmes ved romtemperatur, gir varmstartteknologi stor bekvemmelighet for å forberede flere PCR-reaksjonssystemer ved romtemperatur uten å ofre spesifisiteten til PCR-reaksjoner.
2. RT-PCR
RT-PCR (Revers transcription PCR) er en eksperimentell teknikk for revers transkripsjon fra mRNA til cDNA og bruke det som en mal for amplifikasjon.Den eksperimentelle prosedyren er å ekstrahere totalt RNA i vev eller celler først, bruke Oligo (dT) som en primer, bruke revers transkriptase for å syntetisere cDNA, og deretter bruke cDNA som en mal for PCR-amplifisering for å oppnå målgenet eller påvise genuttrykk.
3. Fluorescerende kvantitativ PCR
Fluorescerende kvantitativ PCR (sanntids kvantitativ PCR,RT-qPCR) refererer til metoden for å legge til fluorescerende grupper til PCR-reaksjonssystemet, ved å bruke akkumulering av fluorescerende signaler for å overvåke hele PCR-prosessen i sanntid, og til slutt bruke standardkurven for å kvantitativt analysere malen.Vanlige brukte qPCR-metoder inkluderer SYBR Green I og TaqMan.
4. Nestet PCR
Nested PCR refererer til bruken av to sett med PCR-primere for to runder med PCR-amplifikasjon, og amplifikasjonsproduktet i den andre runden er målgenfragmentet.
Hvis en mismatch av det første paret primere (ytre primere) fører til at et ikke-spesifikt produkt blir amplifisert, er muligheten for at den samme ikke-spesifikke regionen gjenkjennes av det andre primerparet og fortsetter å amplifisere svært liten, så amplifikasjon med det andre primerparet, har spesifisiteten til PCR blitt forbedret.En fordel med å utføre to runder med PCR er at det bidrar til å forsterke tilstrekkelig produkt fra begrenset start-DNA.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR er en metode for å forbedre spesifisiteten til PCR-reaksjonen ved å justere PCR-syklusparametrene.
I touchdown PCR settes annealingstemperaturen for de første syklusene noen få grader over den maksimale annealingstemperaturen (Tm) for primerne.Høyere annealingstemperatur kan effektivt redusere uspesifikk amplifikasjon, men samtidig vil høyere annealingstemperatur forverre separasjonen av primere og målsekvenser, noe som resulterer i redusert PCR-utbytte.Derfor, i de første par syklusene, er annealingstemperaturen vanligvis satt til å synke med 1°C per syklus for å øke innholdet av målgenet i systemet.Når glødetemperaturen senkes til den optimale temperaturen, opprettholdes glødetemperaturen i de gjenværende syklusene.
6. Direkte PCR
Direkte PCR refererer til amplifisering av mål-DNA direkte fra prøven uten behov for nukleinsyreisolering og rensing.
Det finnes to typer direkte PCR:
direkte metode: ta en liten mengde prøve og legg den direkte til PCR Master Mix for PCR-identifikasjon;
cracking-metode: etter prøvetaking, legg den til lysatet, lysér for å frigjøre genomet, ta en liten mengde lysert supernatant og legg den til PCR Master Mix, utfør PCR-identifikasjon.Denne tilnærmingen forenkler den eksperimentelle arbeidsflyten, reduserer praktisk tid og unngår DNA-tap under rensetrinn.
7. SOE PCR
Genspleising ved overlappende forlengelse PCR (SOE PCR) bruker primere med komplementære ender for å få PCR-produkter til å danne overlappende kjeder, slik at i den påfølgende amplifikasjonsreaksjonen, gjennom forlengelsen av de overlappende kjedene, forskjellige kilder til A-teknikk der amplifiserte fragmenter overlappes og skjøtes sammen.Denne teknologien har for tiden to hovedanvendelsesretninger: konstruksjon av fusjonsgener;gen sted-rettet mutasjon.
8. IPCR
Invers PCR (IPCR) bruker revers komplementære primere for å amplifisere andre DNA-fragmenter enn de to primerne, og ampliserer ukjente sekvenser på begge sider av et kjent DNA-fragment.
IPCR ble opprinnelig designet for å bestemme sekvensen til tilstøtende ukjente regioner, og brukes mest til å studere genpromotorsekvenser;onkogene kromosomale omorganiseringer, slik som genfusjon, translokasjon og transposisjon;og viral genintegrasjon, er også ofte brukt nå. For stedsrettet mutagenese, kopier et plasmid med ønsket mutasjon.
9. dPCR
Digital PCR (dPCR) er en teknikk for absolutt kvantifisering av nukleinsyremolekyler.
Det er for tiden tre metoder for kvantifisering av nukleinsyremolekyler.Fotometri er basert på absorbansen av nukleinsyremolekyler;sanntids fluorescerende kvantitativ PCR (Real Time PCR) er basert på Ct-verdien, og Ct-verdien refererer til syklusnummeret som tilsvarer fluorescensverdien som kan påvises;digital PCR er den siste kvantitative teknologien basert på enkelt-molekyl PCR metode for telling av nukleinsyre kvantifisering er en absolutt kvantitativ metode.
Innleggstid: 13. juni 2023